Принципи на синтеза на нуклеинова киселина

Синтезът на нуклеинова киселина се извършва с помощта на твърдофазния сиалов амид триглицеридния метод, при който 3' краят на ДНК се имобилизира върху твърдофазов субстрат и се добавят нуклеотиди в посока 3' към 5', докато се синтезира желаният ДНК фрагмент .Това се различава от синтеза на ДНК чрез прилагането на ДНК полимераза.

3'-краят на първата база е имобилизиран върху CPG по време на синтеза, 5'-ОН на следващата база е защитен с ди-р-толил тритил DMT, аминогрупата на основата е защитена с бензоена киселина и 3' -OH след това се активира с аминофосфатно съединение.1 база от 5 5'-OH на 1 база и 3'-OH от следващата база образуват фосфитен триглицерид, който след това се окислява с йод до фосфатен триглицерид, протекторът на втората база 5'-OH се отстранява чрез добавяне на дихлороцетна киселина DM цикли чрез добавяне на следващата основа и след синтез защитното средство върху 5'-OH се отстранява със слаба киселина. Фрагментът се отделя от твърдата смола с концентриран амониев хидроксид, защитният агент се отстранява от основата с концентриран амониев хидроксид при нагряване, амониевият хидроксид се отстранява, фрагментът се суши под вакуум и нуклеиновата киселина се пречиства чрез течна хроматография или PAGE.

Етапи на олигосинтеза

Деблокиране

The5 край DMT защитната група се отстранява чрез добавяне на TCA разтвор.

Активиране

Смесване на активатора с олигонуклеотидния мономер за образуване на активния олигонуклеотиден мономерен междинен продукт.

Съединител

5-терминалната хидроксилна група реагира с активния олигонуклеотиден междинен продукт в реакция на антигенеративна кондензация, за да образува нестабилна фосфитна триглицеридна връзка.

Запушване 

Добавянето на затварящ агент извършва реакция на затваряне на ацетилиране с излишни хидроксилни групи, които не участват в реакцията на кондензация.

Окисляване 

Добавянето на йоден разтвор, съдържащ вода, реагира с нестабилни фосфитни връзки чрез окисление, за да образува стабилни триглицеридни връзки на фосфорната киселина.

Цианоетил разцепване

Продуктът от нуклеинова киселина след синтез, с добавяне на DEA разтвор за отстраняване на цианоетиловата група от фосфатната триглицеридна връзка.

Разцепено и премахване на защитата

Фрагментите на нуклеиновата киселина се отцепват от твърдофазния носител чрез добавяне на концентриран разтвор на амониев хидроксид и след това се нагряват, за да се отстранят защитните групи от водородните връзки на базите.